La preparazione di campioni biologici come ossa, piante, muscoli o espettorato per l'analisi di DNA, RNA, proteine o metaboliti può essere una sfida. RETSCH fornisce mulini da laboratorio che polverizzano e omogeneizzano i campioni solidi, ma sono anche adatti alla disgregazione cellulare. I mulini RETSCH sono utilizzati in settori quali biotecnologia, diagnostica, medicina legale, agricoltura e microbiologia.
La disgregazione cellulare è spesso il metodo scelto per estrarre componenti cellulari da batteri, lieviti, funghi o microalghe e viene effettuata sia chimicamente che meccanicamente. I metodi meccanici sono più adatti per le cellule con pareti resistenti o se le sostanze chimiche possono influenzare l'estrazione e quindi devono essere evitate. Un metodo comune ed efficace è il bead beating, che utilizza perline per tagliare le cellule in una sospensione. La battitura delle microsfere può essere effettuata su piccola o grande scala, utilizzando diversi tipi di fiale e provette. Un modo è quello di mescolare la sospensione con le microsfere e utilizzare un miscelatore vortex. Tuttavia, questa procedura è lenta e incoerente, soprattutto in presenza di un numero elevato di campioni o di lunghi tempi di interruzione. Il procedimento più efficace consiste nell'utilizzo di un Vibro Mulino RETSCH con adattatori che automatizzano il processo, rendendolo veloce, efficiente e riproducibile.
Vibro Mulino MM 400 - Distruzione delle cellule di lievito*
*Il video mostra il modello precedente con lo stesso principio funzionale.
Aumento della riproducibilità della concentrazione di proteine totali dopo la rottura delle cellule, 7 min con
MM 400, 12 min Vortex.
Barre di errore: % di deviazione standard
Il Vibro Mulino MM 400 elabora fino a 20 campioni in provette Eppendorf da 1,5 o 2 ml senza contaminazione incrociata, risparmiando tempo all'operatore. Inoltre, è disponibile un adattatore per ospitare fino a otto provette Falcon da 50 ml. Le dimensioni ottimali delle microsfere per la disgregazione cellulare variano in base al tipo di cellula; per i batteri e i lieviti si consigliano microsfere di vetro da 0,75 a 1,5 mm, mentre per i funghi e le microalghe sono più adatte microsfere più piccole da 0,1 a 0,5 mm.
Per l'estrazione del DNA o dell'RNA, sono ideali le provette monouso più piccole, fino a 2 ml, mentre le fiale più grandi, come le provette Falcon da 50 ml, sono adatte al trattamento di proteine o metaboliti. I parametri ottimali di battitura delle microsfere variano a seconda del tipo di cellula. Potrebbe essere necessario fare qualche esperimento per trovare i risultati migliori. In genere, sono necessari da 30 s (per la maggior parte delle microalghe) a 7 min (per i lieviti in generale) di battitura delle microsfere per disgregare completamente le cellule.
Accettando fino a cinquanta fiale monouso da 2 ml, il Vibro Mulino MM 500 vario aumenta efficacemente la produttività dei campioni.
Cellule di Phaeodactylum tricornutum prima (a sinistra) e dopo la disgregazione cellulare (a destra) con il Vibro Mulino MM 400 in combinazione con l'adattatore per provette Falcon.
La temperatura gioca un ruolo cruciale, soprattutto nelle applicazioni in cui sono coinvolte proteine sensibili alla temperatura. Una soluzione è la macinazione criogenica (vedi sezione corrispondente), l'altra è il raffreddamento della sospensione cellulare. Per l'MM 400 stato dimostrato che l'aumento di calore nelle provette da 2 ml è moderato anche a 30 Hz; un modo semplice è quello di interrompere i tempi di interruzione >1 minuto raffreddando l'adattatore con le provette in un bagno di ghiaccio per un minuto. In questo modo, la temperatura rimarrà al di sotto dei 12-15°C, a seconda delle dimensioni delle microsfere utilizzate.
Aumento della temperatura durante la disgregazione delle cellule nel MM 400 a 30 Hz o con un Vortexer, raffreddamento con ghiaccio dopo ogni minuto di disgregazione delle cellule.
Un modo per controllare l'andamento della temperatura nella battitura delle microsfere è l'utilizzo del Vibro Mulino MM 500 Control. Ano speciale adattatore ospita diciotto fiale monouso da 2 ml per lotto. La macchina è collegata a un refrigeratore con acqua raffreddata a 4°C che a sua volta raffredda l'adattatore che contiene le fiale. In questo modo, la temperatura della sospensione viene mantenuta a circa 13°C, ma senza le scomode fasi di interruzione manuale in un bagno di ghiaccio. MM 500 Control non accetta l'adattatore monouso per provette Falcon, ma può essere utilizzato con giare di macinazione in acciaio inox da 50, 80 o 125 ml (vedi esempio a sinistra: P. pastoris).
Se il mulino viene utilizzato con azoto liquido e CryoPad e impostato su una temperatura di 0 °C, la temperatura della sospensione cellulare in provette monouso da 2 ml può essere mantenuta a 0 °C senza congelare la sospensione, in modo che sia ancora possibile un battito efficace delle microsfere.
Alcuni campioni biologici, come l'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica o campioni di tessuto come fegato, polmoni o tumori, sono talvolta più difficili da omogeneizzare completamente. Le provette monouso da 2 ml sono spesso troppo piccole per contenere l'intero volume del campione, quindi il campione deve essere diviso e ricombinato dopo il processo di omogeneizzazione, il che aggiunge ulteriore lavoro e tempo alla routine di laboratorio.
Le giare di macinazione più grandi in acciaio inossidabile, ad esempio, possono contenere l'intero volume del campione, ma devono essere puliti dopo ogni utilizzo. Un adattatore per il Vibro Mulino MM 400 risolve questo problema consentendo l'uso di provette monouso da 5 x 5 ml, che hanno una maggiore capacità e non richiedono la pulizia. Per ogni lotto, è possibile omogeneizzare 10 campioni contemporaneamente. Le provette Falcon da 50 ml possono essere utilizzate anche per omogeneizzare i campioni di tessuto. In questo caso, 8 campioni per lotto possono essere processati in pochi minuti.
Campione di fegato prima e dopo l'omogeneizzazione con MM 400
Alcuni campioni biologici, come piante fibrose, vene dure, unghie o alcuni tessuti animali o tumorali, sono difficili da omogeneizzare in un sistema tampone. Sono troppo morbidi, troppo duri o troppo fibrosi per essere polverizzati efficacemente in sospensione. Un'alternativa migliore per questi campioni è la macinazione criogenica, che prevede il congelamento con azoto liquido prima o durante il processo di macinazione. Questa tecnica rende i campioni fragili e facili da frantumare in polveri omogenee. La macinazione criogenica ha anche il vantaggio di preservare l'integrità, ad esempio, delle proteine o dei composti volatili che potrebbero degradarsi o evaporare a temperature più elevate. Inoltre, la macinazione criogenica può rompere gli organelli intracellulari di alcuni organismi, come il lievito.
Per i campioni appiccicosi, come le bacche, la macinazione criogenica è spesso l'unico metodo possibile per ottenere un campione uniforme. La tabella elenca alcuni esempi di campioni che sono stati trattati con successo mediante macinazione criogenica nel Vibro Mulino MM 400 o nel CryoMill. Per la macinazione criogenica nell'MM 400 si possono utilizzare provette in acciaio da 2 ml. Effetti simili possono essere ottenuti nel Vibro Mulino MM 500 control con giare di macinazione fino a 125 ml per volumi maggiori. In questo caso è possibile utilizzare il CryoPad per lavorare con azoto liquido. In tutti i mulini citati, sono disponibili anche tubi in acciaio inox da 2 ml e relativi adattatori per volumi più piccoli.
Tubi in acciaio inox da 2 ml
| Campione | Accessori | Quantità in ingresso | Tempo di macinazione | Velocità | Max finezza finale (d90)/ |
| E. coli batteri |
|
2 pellet di cellule congelate da 10 ml | 2 min | 30 Hz | completa distruzione cellulare |
| tessuto muscolare |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | <150 µm |
| aghi di pino |
|
3 min | 30 Hz | Estrazione riproducibile dell'RNA di 20 campioni in un unico passaggio | |
| berries |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| unghie delle mani |
|
1 unghia per fiala | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| intestino di topo |
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1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Pezzi di carne prima e dopo la macinazione criogenica
Bacche appiccicose
prima e dopo la macinazione criogenica
Aghi di pino
prima e dopo la macinazione criogenica
Gel di agarosio per la separazione dell'RNA da aghi di pino polverizzati che mostra una buona riproducibilità e quantità di RNA preparato
I campioni forensi come capelli, ossa e denti sono per lo più fragili e quindi non necessitano di raffreddamento prima della polverizzazione. Per ottenere la finezza analitica desiderata, i campioni possono essere sottoposti a una frantumazione preliminare in un Frantoio a mascelle o in un Mulino a Taglienti per ridurre le dimensioni delle particelle al di sotto dei 10 mm per la successiva lavorazione in un Mulino a Sfere. I mulini a taglienti sono utilizzati per la pre-frantumazione di ossa che possono essere fresche e quindi non completamente asciutte e possono anche contenere residui di carne.
RETSCH offre una gamma di mulini a taglienti per la riduzione primaria delle dimensioni di materiali morbidi, medio-duri, elastici, tenaci e fibrosi. L'ampia gamma di accessori consente un adattamento ottimale alle varie applicazioni. Il mulino a taglienti SM 300 può essere dotato di tre diversi rotori e setacci inferiori da 0,25 mm a 20 mm. A differenza delle ossa fresche e grasse, le ossa secche possono essere ridotte a una dimensione inferiore a 0,25 mm in una o due fasi. L'SM 300 ha una velocità variabile da 100 a 3.000 giri/min. La polverizzazione di ossa, denti o peli avviene per lo più in mulini a sfere che utilizzano sfere > 5 mm in acciaio, ossido di zirconio o carburo di tungsteno.
Campione di osso prima e dopo la macinazione con un mulino a taglienti
Capelli umani prima e dopo la macinazione fine in un vibro mulino
Una delle potenziali complicazioni di un intervento di sostituzione dell'articolazione, come nel caso di gomiti o ginocchia, è l'infezione dei tessuti circostanti da parte di vari batteri. Queste infezioni, chiamate infezioni articolari protesiche (PJI), possono verificarsi da pochi giorni a diversi anni dopo l'intervento. Sono difficili da trattare perché possono essere causate da diversi tipi di batteri e non sempre vengono individuate con i metodi convenzionali. Pertanto, è necessario isolare i batteri dai campioni di tessuto in modo da preservarne la vitalità e consentirne l'identificazione e la coltivazione.
È qui che il Vibro Mulino MM 400 può aiutare con una semplice procedura: I campioni vengono mescolati con 20 ml di acqua demineralizzata sterile e 5 ml di microsfere di vetro da 1 mm in una giara di acciaio sterilizzato. È possibile utilizzare bottiglie monouso a bocca larga da 30 ml. 8 bottiglie vengono agitate per 3,5 minuti a 30 Hz per rimuovere i batteri dai campioni senza distruggerli. I batteri possono quindi essere facilmente coltivati su una piastra di agar per ulteriori analisi. Questo metodo ha un'alta percentuale di rilevamento (A.-L. Roux et. al 2010) e può essere applicato a qualsiasi campione di tessuto solido infetto, anche se contiene materiale impiantato.
Grazie alla sua fitta rete internazionale composta da filiali, agenzie locali e società satellite, RETSCH è presente in più di 80 paesi garantendo elevati standard qualitativi e di competenza tecnica. Nei nostri laboratori applicativi, utilizzatori e potenziali clienti possono processare GRATUITAMENTE i propri campioni, in modo da poter valutare l'idoneità di sistemi proposti, prima di un eventuale acquisto. Le prove effettuate saranno inoltre accompagnate da un report di macinazione, riportante tutte le informazioni inerenti la prova (setting strumentali, strumenti ed accessori utilizzati)
Il bead beating un metodo meccanico ampiamente utilizzato per la disgregazione delle cellule, è fondamentale per estrarre componenti cellulari da microrganismi come batteri, lieviti, funghi o microalghe. Questo processo implica l'uso di microsfere per tagliare le cellule in una sospensione e può essere condotto su scale diverse utilizzando fiale e tubi diversi. L'automazione fornita dai mulini miscelatori RETSCH con adattatori ottimizza il processo di battitura delle microsfere, assicurando che sia veloce, efficiente e riproducibile.
La dimensione ottimale delle microsfere e i parametri dipendono dal tipo di cellula e richiedono una sperimentazione per ottenere i risultati migliori. L'MM 400, ad esempio, può processare fino a 20 campioni in provette Eppendorf da 1,5 o 2 ml senza contaminazione incrociata. Un adattatore disponibile consente di alloggiare fino a otto provette Falcon da 50 ml, aumentando la versatilità del processo.
La macinazione criogenica diventa essenziale quando si trattano campioni difficili che resistono all'omogeneizzazione nei sistemi di tamponamento convenzionali. Ciò è particolarmente vero per le piante fibrose, le vene dure, le unghie o specifici tessuti animali o tumorali. La tecnica prevede l'applicazione di azoto liquido per congelare i campioni prima o durante il processo di macinazione. Il congelamento criogenico rende i campioni fragili, facilitando la loro frantumazione in polveri omogenee.
Il processo di macinazione criogenica offre notevoli vantaggi, preservando l'integrità delle proteine o dei composti volatili che potrebbero degradarsi o evaporare a temperature più elevate. Inoltre, si dimostra efficace nella disgregazione degli organelli intracellulari in alcuni organismi. In particolare, la macinazione criogenica è l'unico metodo praticabile per ottenere campioni uniformi di materiali appiccicosi, come le bacche.
Per ottenere risultati ottimali, la macinazione criogenica può essere effettuata utilizzando apparecchiature specializzate come il CryoMill o il Mixer Mill MM 400, che può ospitare tubi di acciaio da 2 ml. Il Mixer Mill MM 500 control, progettato specificamente per lavorare con l'azoto liquido (LN2), accetta giare di macinazione più grandi, fino a 125 ml.
Quando si tratta di polverizzare campioni forensi come ossa o denti, i frantoi a mascelle o i mulini da taglio sono la scelta ottimale per la prima fase del processo di riduzione delle dimensioni. RETSCH fornisce una vasta gamma di mulini da taglio progettati per la riduzione primaria delle dimensioni di una varietà di materiali campione, tra cui sostanze morbide, mediamente dure, elastiche, resistenti e fibrose. L'ampia gamma di accessori assicura che questi mulini possano essere adattati alle varie applicazioni senza problemi.
Il versatile SM 300, ad esempio, vanta tre diversi rotori e setacci inferiori da 0,25 mm a 20 mm, oltre a una velocità variabile da 100 a 3.000 giri/min. Questa flessibilità lo rende uno strumento eccellente per adattarsi alle specifiche esigenze di trattamento dei campioni forensi.
Per le fasi di lavorazione successive, si consiglia di utilizzare mulini a sfere dotati di sfere di dimensioni superiori a 5 mm, realizzate con materiali come acciaio, ossido di zirconio o carburo di tungsteno. Per la polverizzazione dei capelli, i mulini come l'MM 400 sono la scelta migliore.
